前回(2022-07-03)の続きです。今回は、溶離曲線が近似的に正規分布をすると仮定して、溶離曲線の式を求め、重要なパラメータである溶離曲線の幅・理論段数・理論段高さ等について述べます。　　　

<<二項分布の正規分布近似>>
前回、n×v mLの溶離液がカラムに加えられた後、カラムの最終段pにおける間隙溶液中の成分分率L_{n, p}は次式で与えられることを示しました。
L_{n, p} = n!/(p!(n－p)!)(D^n-p/(1+D)ⁿ⁺¹)
ここで、溶出液の各フラクションの試料成分の濃度をC (mol/L)とすると、溶液は最終段から溶出液中へ流出するので、
C = QL_{n, p}/v　　　
ここで、Q：試料成分の全物質量(mmol)
v：理論段１段の間隙体積(mL)
となります。　　　

L_{n, p}は二項分布に従います。統計学の教えるところによれば、n, pが十分大きいとき、二項分布は正規分布で近似できることが知られています(証明は省略します)。　　　

<<正規分布で表した溶離曲線>>
溶離曲線が正規分布に従えば、カラムから出てきた溶出液の濃度C (mol/L)は、次式で与えられます。
C = C*exp{－N(V－V*)^{^2}/(2V*V)}　…①
ここで、
C：溶出液体積Vのときの溶出液濃度(mol/L)
C*：溶出液の最大濃度^(*1) (mol/L)

V：溶出液体積(=溶離液の体積) (mL)
V*：最大濃度における溶出液体積(=保持容量) (mL)
N：カラムの理論段数
(*1) C* =(Q/V*)√(N/(2π))で与えられる。　　　

<<溶離曲線のパラメータ>>
＜最大濃度における溶出液体積V*＞
前回(2022-07-03)述べたように、
V* = V_i＋GD_g　…②
V_i：カラム中樹脂の全間隙体積(mL)
G：カラム中の乾燥イオン交換樹脂の質量(g)
D_g：質量分配係数 (mL/g)
となります。
また、もし分配係数が容量分配係数D_vで与えられたときは、
V* = V_i＋V_resinD_v　…②’
V_resin：カラム中のイオン交換樹脂の容積(mL) = (カラムの断面積(a cm²)×樹脂柱長さ(L cm))
D_v：容量分配係数 = (水中樹脂1mL当りの成分量)/(溶液1mL当りの成分量)^(*2)
(*2) D_v＝ρD_g　(ρ: 密度。一般のイオン交換樹脂ではρ≒0.3～0.4 g/mL)
分配係数の値が十分に大きいときは、V_iの値(一般にV_i≒0.4V_resin)は無視することができる。
V* ≒ D_g×G ≒D_v×V_resin　…②’’　　　

このように、溶離曲線の最大濃度の溶出液体積V*は分配係数の関数となります。　　　　

＜理論段数と溶離曲線の幅＞
溶離曲線が正規分布に従うならば、①式から、
C/C* = exp{－N(V－V*)^{^2}/(2V*V)}
CをC_e = C/e (eは自然対数の底)で置き換えると、
C_e/C* = exp{－N(V_e－V*)^{^2}/(2V*V_e)} = e^{^-1}
つまり、
N = 2V*V_e/(V_e－V*)^{^2}　　　

もし、V*とV_eの差が小さければ、
N≒2V*^{^2}/(V_e－V*)^{^2}
ここで、C_eを与える溶離曲線の幅をW_eとすると、
W_e = 2(V_e－V*)
N≒8V*^{^2}/W_e^{^2}
つまり、
W_e≒2√2×V*/√N　…③

したがって、溶離曲線の幅は最大濃度における溶出液体積(V*)と理論段の大きさ(N)によって決まります。　　　　　　

＜理論段高さ＞
理論段数一段当りの長さ(理論段高さ=HETP (Height equivalent to a theoretical plate )(h)は樹脂柱の長さ(L)を理論段数(N)で割った値で与えられます。
h ＝ L/N　…④　

<<正規分布(μ,σ)と溶離曲線の関係>>
＜μ,σとV*, Nの関係＞
一般に、正規分布は、平均値μおよび標準偏差σを用いて、
f(x) = (1/√(2πσ^{^2}))exp{－(x－μ)^{^2}/(2σ^{^2})}　…⑤
で表されます。
したがって、溶離曲線が正規分布を取り、VがV*の付近であれば、
C = C*exp{－N(V－V*)^{^2}/(2V*^{^2})}　…①’
で近似できるので、
x = V
μ = V*　…⑥
σ^{^2} = V*^{^2}/N
σ = V*/√N = V*√(h/L) 　…⑦
の関係が得られます^(*3)。
(*3) C*=(Q/V*)√(N/(2π))=Q/√(2πσ^{^2})なので、C=Qf(V)となる。　　　

したがって、V*およびN(=h/L)が分かればμおよびσが分かり、統計的手法を用いて溶離曲線を取り扱うことが可能となります。これまで述べた関係を図-１に示します。　　　　　

図-1

＜溶離曲線の面積割合とμ,σの関係＞
溶離曲線において溶離曲線以下の全面積(S_o)は、カラムに添加した試料成分の全物質量(Q_o)を表します。したがって、たとえばV_x mLまでの溶離曲線面積(S_x)を全面積(So)で割った値は、V_x mLまでに溶出した試料成分量(Q_x)を全物質量(Q_o)で割った値に等しくなります。この値をεと置くと、
S_x/S_o = Q_x/Q_o =ε  (0≦ε≦1)

つまり、εは成分のカラムからの溶出割合(溶出率)を示し、また、V_xからの溶離曲線下の面積割合つまり1－εはカラムへの吸着割合(吸着率)を示します。　　　　　　

エクセルにおいては正規分布に関する関数が組み込まれています。
正規分布関数(f(x))：　溶離曲線に相当
f(x) = (1/√(2πσ^{^2}))exp{－(x－μ)^{^2}/(2σ^{^2})}
累積分布関数(F(x))：　溶離曲線下部の面積に相当
F(x) = ∫_-∞^x f(x)dx = ∫_-∞^x (1/√(2πσ^{^2}))exp{－(x－μ)^{^2}/(2σ^{^2})}dx
について、エクセルでは、
f(x) =NORM.DIST(x,μ,σ,FALSE)　または　=NORM.DIST(x,μ,σ,0)　…⑧
F(x) =NORM.DIST(x,μ,σ,TRUE)　または　=NORM.DIST(x,μ,σ,1)　…⑨
で求めることができます。
また、累積分布関数の逆関数については、
－∞からxまでのF(x)=εを与えるxについて：
x =NORM.INV(ε,μ,σ)　…⑩
で求めることができます。　　　

したがって、溶離曲線が正規分布をする場合、溶離曲線は⑧式で与えられ、V_xを与えたときのV_xまでの溶離曲線下の面積割合つまり溶出率εは⑨式で求められ、吸着率は(1－ε)で与えられます。またεを与えたときのV_xは⑩式で与えられます。　

その様子を図-２に示します。

図-２

図-２において、溶離曲線(緑線)および面積割合の曲線(赤線)は、μ= V* =20, σ= 5 とすると、
f(x) =NORM.DIST(x, 20 , 5 ,FALSE)
F(x) =NORM.DIST(x, 20 , 5 ,TRUE)
で与えられます。
また、図-２において、V=V*＋2σつまりx=μ＋2σ=20＋2×5=30におけるF(x)は、
F(30) =NORM.DIST(30, 20 , 5 ,TRUE) = 0.977
したがって、図のピンク色部分の面積の割合(溶出率)は、全体の97.7%ということになります。

また逆に、ε= 0.977が与えられると、
x =NORM.INV(0.977, 20, 5)=30
となります。

V = V*＋kσにおいて、kは信頼係数と呼ばれます。V*およびσが既知のとき、kの値を決めると(上の例ではk=2)εの値が決まります。またεを決めるとｋの値が決まります。k(信頼係数)とε(溶出率)の関係を下表に示します。たとえば、溶出率が0.01％となるときのk値は－3.09、溶出率が99.9％となるときのk値は＋3.09です。　　　

<<カラム法による成分分離>>

＜分離度＞
金属イオンM_a, M_b (D_a＜D_b)があり、カラム法でM_aとM_bの分離可能かどうかの判断指標として分離度を考えます。ここでは、分離度（R_s：Resolution）を溶離曲線の2つのピークの頂点間の距離をピーク幅の平均値で割った値と定義します。
R_s = 2(V_b*－V_a*)/(W_a＋W_b)
溶離曲線が正規分布をしていると仮定し、分離度で用いるピーク幅を
W_a = 4σ_a, W_b = 4σ_b
とすると、
R_s = (V_b*－V_a*)/(2(σ_a＋σ_b))　　…⑪
V_a*とV_b*が非常に近く、σ_a=σ_b=σとすると、分離度は次式で与えられます。
R_s = (V_b*－V_a*)/(4σ)　　…⑪’
また、ピーク幅としてピーク高さの1/2を与える幅(W_1/2)を用いると、⑥式は、
R_s = 1.18(V_b*－V_a*)/(W_1/2,a＋W_1/2,b)　…⑪’’
と同等です。⑪’’式はJISや日本薬局方で用いられている定義です。溶離曲線が正規分布をしているならば⑪式と⑪’’式は等価です。　　　

＜分離度と溶離曲線の重なり具合＞
金属イオンM_a, M_b (D_a＜D_b)があり、その溶離曲線が正規分布を取り、かつM_aとM_bの標準偏差が同じ場合を考えます。
金属イオンM_a, M_bの溶離帯の重なり具合は、溶離曲線の面積の重なり具合で判断できます。その重なり具合の例を図-３に示します(σ_a=σ_b =σ)。　　　

図-３

信頼係数kと面積割合いの関係表(上記)から分かるように、たとえばM_aが99.9％溶出したときM_bが0.1％以下であるためには、V*a－V*b = 2×3.09σ以上が必要であり、分離度R_sは2×3.09σ/4σ=1.55以上になる必要があります。また、M_aが99.99％溶出したときM_bが0.01％以下であるためには、分離度R_s＝2×3.72σ/4σ=1.86以上が必要です。

これまで「溶離曲線の幅」として、いくつかの定義のことなる値を用いてきました(ピーク高さの1/eにおける幅、標準偏差の4倍(4σ)、ピーク高さの1/2を与える幅)。このように「溶離曲線の幅」の用語は様々な定義があり、論議に混乱が生じやすいので、今後は標準偏差(σ)と信頼係数(k)を用いて話を進めます。　　　　　

より個々の具体的な適用条件や分離例については、次回以降説明します。